Lichtblattmikroskop mit Zweiphotonenanregung

Eigenentwicklung eines Mikroskops mit großem homogenen Sichtfeld
 

Konfokalmikroskope sind aus gutem Grund die vielleicht meistgenutzten Mikroskope im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie. Trotzdem haben sie einige Nachteile, im Vergleich zur Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie

 

• ist die Aufnahmegeschwindigkeit sehr langsam, da jeweils nur ein Pixel abgebildet wird
• sind Phototoxizität und Ausbleichen relativ stark, insbesondere wenn 3D-Volumina erfasst werden

Bei der Standard-Lichtblattmikroskopie wird ein sehr dünner fokussierter Lichtstreifen zur Anregung der Fluorophore in der Probe verwendet. Das Fluoreszenzlicht wird mit einem zweiten, üblicherweise orthogonal ausgerichteten Objektiv abgebildet.
Auf diese Weise wird nur das abgebildete Volumen beleuchtet, was das Ausbleichen und die Phototoxizität stark reduziert. Die Aufnahme erfolgt mit einer Kamera, die ein hochgradig parallelisiertes Auslesen und eine enorme Steigerung der Aufnahmegeschwindigkeit ermöglicht. Moderne sCMOS-Kameras bieten eine doppelt so hohe Quanteneffizienz im Vergleich zu Detektor im Konfokalmikroskop, was sowohl die Aufnahmegeschwindigkeit als auch das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht.
Allerdings ist die erreichbare Auflösung im Vergleich zu einem sehr guten konfokalen Mikroskop in der Regel etwas geringer. Sie ist insbesondere in den Bereichen außerhalb des Lichtblattfokus beeinträchtigt, in welchen das Lichtblatt aufgrund der Divergenz des Lichts dicker wird.
Um die Vorteile beider Systeme zu kombinieren, haben wir einen speziellen Lichtblattaufbau ("Santoku") entwickelt, der die 2-Photonen-Anregung nutzt, um die Streuung in der Probe zu reduzieren und eine tiefere Durchdringung zu erreichen. Durch axiales Scannen des Lichtblattes über einen großen FOV von 1,2 mm x 1,2 mm erreichen wir ein homogenes Lichtblatt mit ausgezeichneter axialer Auflösung über den gesamten Scanbereich. Das Santoku-Mikroskop unterstützt Brechungsindizes zwischen 1,33 (Wasser) und 1,55 (Cubic und iDISCO) und hat eine Auflösung von etwa 0,6 µm x 0,6 µm x 3 µm, und unterstützt dabei Proben bis zur Größe eines Mäusegehirn. Ein ganzes Mäusegehirn kann in etwa 2 Stunden abgebildet werden (je nach Auflösung).